重组人胰岛素类似物的HPLC分析

目的：探讨HPLC分析在重组人胰岛素类似物鉴别和杂质检测中的适用性。方法：采用反相色谱柱(C18)，以硫酸钠-磷酸缓冲液(0.2mol.L-1，pH2.3)和乙腈为流动相，流速0.8或1.0mL.min-1，柱温40℃，检测波长214nm；用分子筛柱(ZorbaxGF250)以磷酸铵缓冲液(0.1mol.L-1，pH7.5)和乙腈为流动相，流速0.5mL.min-1，检测波长214nm；检测重组人胰岛素类似物及其酶解片段。结果：获得胰岛素及其类似物的RP-HPLC图谱，肽图谱和体积排阻色谱(HPSEC)图。结论：本文方法能够有效地区别和检测胰岛素类似物及有关物质，为该类药物的质控提供了科学依据。

　　关键词：重组人胰岛素类似物肽图谱反相液相色谱体积排阻色谱

　　重组人胰岛素类似物(rhInsulinlispro)是重组人胰岛素分子B链上第28位的脯氨酸和第29位的赖氨酸位置互换产物。其降血糖作用更迅速。临床上作为快速降糖药物，其制剂的商品名为优泌乐(HumalogTM)，该药已被FDA批准上市，并进口我国。在药品检验中，如何区分一级结构仅有微小差别的人胰岛素和人胰岛素类似物，本文试用RP-HPLC法和HPSEC法对其分子或酶解片段进行了分析。

　　1、仪器与材料

　　1.1仪器岛津LC-10AD泵、CTO-10A柱温箱、SPD-10A检测器、DGU-4A脱气机、C-R7Aeplus积分仪。

　　1.2材料重组人胰岛素类似物(rhInsulinlispro)对照品及其注射液(HumalogTM)、B30脱苏氨酸重组人胰岛素由美国Elilly公司提供；重组人胰岛素对照品、重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素对照品、猪胰岛素-A21脱氨猪胰岛素对照品、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品(中国药品生物制品检定所)；重组人胰岛素为国产原料；V8蛋白酶为Sigma产品；乙腈为色谱纯试剂，其它试剂均为国产分析纯。

　　2、方法与结果

　　2.1 肽图谱测定取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛素对照品和B30脱苏氨酸重组人胰岛素适量，用0.1%的CF3COOH溶液制成每1mL中含10mg的溶液；取20μL，加0.2mol.L-1Tris-盐酸缓冲液(pH7.3)20μL，0.1%V8蛋白酶溶液20μL，水140μL，混匀，置37℃水浴2h后，加85%的磷酸溶液3μL终止反应，作为酶解样品溶液；另取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛素对照品和B30脱苏氨酸重组人胰岛素适量，以水代替V8蛋白酶同法制备非酶解样品溶液。采用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250mm×4.6mm)；柱温40℃；流速1.0mL.min-1；检测波长214nm；以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90∶10)为流动相A，乙腈-水(50∶50)为流动相B；进行梯度洗脱。初始状态为10%B，5min时流动相B增至20%，45min时流动相B增至60%，保持5min。取上述酶解样品溶液和非酶解样品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　1. 重组人胰岛素类似物酶解样品

　　2. B30脱苏氨酸重组人胰岛素酶解样品

　　3. 重组人胰岛素酶解样品

　　4. 重组人胰岛素非酶解样品

　　5. 重组人胰岛素类似物非酶解样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ—人胰岛素酶解片段代号

　2.2  RP-HPLC鉴别取重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素对照品、牛胰岛素、猪胰岛素-A21脱氨猪胰岛素对照品和重组人胰岛素类似物对照品适量，各用0.01mol.L-1盐酸溶液分别制成每1mL中含2.8mg的溶液，取上述4种溶液等体积混合，制得混合样品溶液；采用SpherisorbODSⅡ(100mm×4.6mm)色谱柱；流速0.8mL.min-1；柱温40℃；检测波长214nm；以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(75∶25)为流动相。分别取各种胰岛素溶液和混合样品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，确定不同保留时间对应的成分。

　2.3  RP-HPLC分析重组人胰岛素类似物及有关物质取A21脱氨人胰岛素类似物对照品适量，用0.01mol.L-1盐酸溶液制成每1mL中含3.5mg的溶液作为系统适用性样品溶液；取重组人胰岛素类似物注射液，用0.01mol.L-1盐酸溶液调pH约为5.3时，其中重组人胰岛素类似物形成白色沉淀，4000g离心10min，取上清液作为空白注射液；采用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250mm×4.6mm)；柱温40℃；流速1.0mL.min-1；检测波长214nm；以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(82∶18)为流动相A；0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(50∶50)为流动相B，洗脱梯度初始状态流动相B为19%，保持60min，在23min内流动相B增至49%，保持5min。取上述样品溶液和重组人胰岛素类似物制剂空白各20μL注入液相色谱仪。

　2.4  HPSEC分析取重组人胰岛素类似物原料、重组人胰岛素类似物制剂、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品用流动相制成浓度为每1mL约含0.7mg(20U)的溶液。采用ZorbaxGF250Special(25cm×9.4mm)分析色谱柱；以0.1mol.L-1磷酸铵缓冲液(pH7.5)-乙腈(65∶35)为流动相；流速0.5mL.min-1；检测波长214nm。取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　3、讨论

　3.1 鉴别重组人胰岛素类似物的分子结构如图5所示。实验中使用的V8蛋白酶能专一裂解谷氨酸的羧基端肽键。在非还原条件下，用V8酶水解重组人胰岛素类似物分子，理论上可产生4个片段，即Ⅰ(A5-17与B1-13)、Ⅱ(A18-31与B14-21)、Ⅲ(B22-30)、Ⅳ(A1-4)。而在本实验条件下，则多了一个中间片段，即Ⅴ(A1-17与B1-13)，这是片段Ⅰ和Ⅳ聚合的结果。人胰岛素和B30脱苏氨酸人胰岛素以及重组人胰岛素类似物的酶解片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的保留时间是相同的，分别为1460、730、220和1600s，但片段Ⅲ的保留时间则有差别，分别为660和550以及630s。由此可见，通过肽图谱分析鉴别胰岛素类似物是非常有效的。由图2可见，本文的RP-HPLC方法能有效地区分人、猪、牛胰岛素和重组人胰岛素类似物。此法快速、不受其它成分干扰。

　3.2 杂质分析重组人胰岛素类似物在高温高湿度条件下，易产生高分子量蛋白(HMWP)，如在40℃，75%相对湿度下，HMWP的增加速率为每天0.16%；而在酸性条件下，易形成脱氨产物，如其酸性溶液在室温放置时，A21脱氨重组人胰岛素类似物的增加速率为每天0.6%。本文据此制备系统适用性样品，在RP-HPLC线性梯度洗脱分析中，重组人胰岛素类似物与其A21脱氨产物的分离度为2.6，按重组人胰岛素类似物峰计算，其理论塔板数为5350；而在HPSEC分析中，分离度以二聚体峰高与单体和二聚体间的峰谷高之比表示，其值应大于2.0，按重组人胰岛素类似物单体峰计算，其理论塔板数为6200。

　　综上所述，本文方法能有效地区分人、牛、猪胰岛素与人胰岛素类似物，能检测分离人胰岛素类似物及有关物质和高分子量蛋白。结果为该类药物的质控提供了科学依据。